Некоторые новые представления о причинах формирования стимулирующих эффектов КВЧ-излучения

Некоторые новые представления о причинах формирования стимулирующих эффектов КВЧ-излучения

Некоторые новые представления о причинах формирования стимулирующих эффектов КВЧ-излучения

На основании собственных и литературных данных авторами сформулированы некоторые положения, которые дают возможность предложить общий механизм действия миллиметровых волн на фотосинтезирующие организмы.

По мнению авторов одной из важнейших причин стимулирующего эффекта однократного КВЧ-облучения низкой интенсивности на фотосинтезирующие объекты может быть развитие самоускоряющихся механизмов, реализующихся через первичные реакции автокаталитического типа, идущие в липидной фазе клеток.

On the base of own and literary dates authors are formulated some positions, which will enable to offer the general mechanism of action of millimeter waves on photosynthetic cells. In authors opinion one of important reasons of once action of EHF-irradiation of low intensity on photosynthetic objects can be the development of self-acceleration mechanisms realizing thanks to the rise of primary reactions of autocatalytic type going in lipid phase of cells.

Действие КВЧ-излучения (электромагнитное излучение миллиметрового диапазона нетепловой интенсивности) интенсивно изучается в последние 25 лет на различных биологических объектах (от бактерий до тканей и органов человека) и модельных системах, а также используется в практической медицине, что привело к созданию КВЧ-терапии [1]. В последние годы на фоне значительного ряда работ по действию ММ-излучения на живые организмы возникло новое направление, заключающееся в действии этого фактора на фотосинтезирующие объекты [2 - 13] и реакционные центры фотосинтезирующих бактерий [14 - 16].

Обзор экспериментальных данных по действию миллиметровых волн на биологические объекты свидетельствует о возможности существования таких механизмов взаимодействия ММ волн с клетками растительного или животного происхождения, которые затрагивают фундаментальные аспекты их жизнедеятельности.

В настоящее время выдвинуты довольно многочисленные гипотезы относительно первичных механизмов действия КВЧ-излучения на биологические объекты, однако это не внесло ясности в изучаемый вопрос.

Цель работы - предложить общий механизм действия КВЧ-излучения на фотосинтезирующие объекты. На протяжении ряда лет нами проводились приоритетные исследования взаимодействия КВЧ-излучения с фотосинтезирующими объектами, в качестве которых использовали цианобактерию Spirulina platensis (Nords.) Geitl.(прокариот) и зеленую морскую одноклеточную водоросль Platymonas viridis Rouch.(эукариот). Были выявлены некоторые общие закономерности этого взаимодействия [17] и изучены различные физиологические эффекты, вызываемые КВЧ-излучением: ускорение роста и увеличение биомассы, интенсификация процессов фотосинтеза, сопровождающаяся повышением выделения кислорода и содержания в клетках фотосинтезирующих пигментов, увеличение экскреции органических соединений в среду, изменение реакционной способности экзометаболитов, изменение транспорта ионов и др. [18].

Полученные нами данные по действию КВЧ-излучения на фотосинтезирующие организмы, начиная с первых работ по этому направлению [2 - 4, 19, 13], позволяют сформулировать несколько положений, которые позже дадут возможность предложить общий механизм действия миллиметровых волн на клетки:

отсутствие О2 в момент облучения культур фотосинтетиков приводило к снятию выраженного стимулирующего действия КВЧ-излучения;

исчезновение стимулирующего эффекта КВЧ-излучения после добавления селенита натрия (Na2SeO3);

несоответствие между малой величиной поглощенной энергии при однократном КВЧ облучении культур фотосинтезирующих организмов (про- и эукариотов) и величиной "ответа", выражающегося в значительном увеличении выхода биомассы (200 - 250 %), интенсивности фотосинтеза (до 350 %), нарастании количества фотосинтезирующих пигментов и уровня экскреции в среду органических соединений,

изменение проницаемости мембран клеток фотосинтетиков при однократном КВЧ-облучении для ряда ионов,

пролонгированное стимулирующее действие КВЧ-излучения на культуры фотосинтетиков, наблюдаемое с уменьшением эффекта в последующих пассажах.

Попытаемся рассмотреть каждое из высказанных положений с учетом имеющихся данных.

Нами было показано, что стимулирующее действие КВЧ-излучения на фотосинтезирующие организмы снималось при отсутствии кислорода в момент облучения (облучение в атмосфере аргона) по следующим показателям: биомассе, выделению кислорода, количеству хлорофилла, уровню фотодыхания [20]. Результаты опытов с заменой воздуха аргоном свидетельствовали о важной роли кислорода в момент облучения клеток, присутствие которого при КВЧ-облучении ответственно, по нашему мнению, за дальнейшее образование и накопление радикальных и перекисных состояний и развитие автокаталитических реакций типа цепных, идущих в липидной фазе мембран с накоплением конечных продуктов, приводящих к изменениям их функционального состояния, подобно тому, как это было показано значительно раньше при облучении клеток ионизирующей радиацией [21]. Весьма вероятно, что при отсутствии кислорода блокируются конформационные сдвиги в белковой фазе мембран, а также окисление сульфгидрильных и иных групп, что может влиять на изменения проницаемости мембран в присутствии кислорода.

Возможный механизм образования Н2О2 предложен в работе, в которой обнаружено образование наномолярных концентраций перекиси водорода под действием микроволнового поля [22].

На возможное образование перекиси водорода при КВЧ-облучении указывали также следующие факты. Ингибирование скорости размножения культуры Bacterium prodigiosum после ММ облучения коррелировало со снижением активности каталазы, разлагающей перекиси, количество которой в клетках снижалось на 25 - 35 % по сравнению с контролем [23].

Как известно, каталаза - важный внутриклеточный фермент-гемопротеид, который катализирует разложение перекиси водорода в клетках, а также участвует в сопряженных окислительных процессах.

Миллиметровое облучение лиофильно высушенных препаратов каталазы, полученной из эритроцитов лошади, выявило инактивацию этого фермента на всех используемых длинах волн в интервале от 3,0 до 6,7 мм [24].

Каталаза, добавленная к облученному буферу, устраняла ингибирующий эффект облучения СВЧ-полем на активности супероксиддисмутазы (СОД), что указывало на образование перекиси водорода в процессе облучения [22].

Некоторыми исследователями обсуждалась возможная роль кислорода, который на резонансных частотах при КВЧ-облучении, по их мнению, мог передавать водородносвязанным молекулам воды часть поглощенной энергии и запускать цепочки возбуждения, обусловливая общую частотную зависимость биологического эффекта [25].

Другие авторы наблюдали конвективное движение в воде вблизи поверхности, на которую падает ММ излучение, что сопровождалось ускорением поступления в кювету кислорода воздуха, о чем судили по скорости нарастания полярографического тока [26]. Из водного раствора в кювете, расположенной на рупоре, струей аргона вытеснялся воздух, а затем с помощью полярографического электрода регистрировалось обратное поступление О2 в раствор. Оказалось, что КВЧ облучение (длина волны 6,5 мм, мощность 0,5 мВт/см2) ускоряет нарастание концентрации О2 в растворе почти в 2 раза. Как считают авторы, под действием ММ волн ускоряется поступление в водный раствор кислорода воздуха за счет конвективного переноса [27], что может объяснять изменения транспортных свойств мембран.

Ускорение транспорта кислорода и других веществ в тканях и клетках, лимитированного переносом через жидкие среды, может являться, по-видимому, наряду с известными частотно-селективными (резонансными) эффектами одним из механизмов физиологического действия КВЧ-излучения низких интенсивностей [27].

Конвективным перемешиванием суспензии липосом и улучшением снабжения кислородом авторы объясняют помимо ускорения перекисного окисления липидов [27], также и ускорение активного транспорта ионов Na+ через кожу лягушки, изменение проницаемости мембран эритроцитов для ионов K+, увеличение проводимости бислойных липидных мембран.

Конвекция, таким образом, может, по мнению перечисленных авторов, являться первичным механизмом действия ММ волн на процессы жизнедеятельности [28], при этом порог чувствительности биологического объекта к непрерывному ММ излучению низкой интенсивности составляет мощности порядка 1 - 10 мВт/см2. В работе [29] на основании этих взглядов дается гипотетический механизм действия ММ волн слабой интенсивности, основанный на вызывании ими гидродинамической неустойчивости вблизи межфазной поверхности и ускорении диффузных процессов и мембранного транспорта.

В обзоре [30] более подробно в сущности рассматривались те же положения в отношении как КВЧ, так и СВЧ излучения, в том числе их действие на суспензии липосом, гетеротрофные микроорганизмы, грибы, мебраны эритроцитов, некоторые другие биологические объекты и приводится схема действия ММ волн низкой интенсивности, основанная на конвективном переносе веществ в воде.

Как известно, перекисное окисление липидов (ПОЛ) представляет собой цепной свободнорадикальный процесс окисления, в том числе ненасыщенных жирных кислот, входящих в клетках в состав молекул фосфолипидов, играющий ведущую роль при радиационных повреждениях, при интоксикациях и других патологических состояниях организма. В результате окисления фосфолипидов увеличивается проницаемость нативных мембран для ионов и других молекул [31].

Исследование влияния ММ волн на процессы ПОЛ в моделях биологических мембран (суспензия липосом в водном растворе) важно для выяснения первичных механизмов действия КВЧ-излучения на биологические объекты. В работе [32], проведенной на модельных системах, при использовании диапазона длин волн от 4,0 до 7,1 мм было обнаружено, что электромагнитное излучение миллиметрового диапазона длин волн ускоряет процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в суспензии липосом при нетепловых мощностях излучения (не более 0,5 мВт/см2, при Lambda = 6,5 мм). Эффект КВЧ-облучения проявлялся при всех исследованных способах иниицирования ПОЛ -- добавление железо-аскорбатной смеси (Fe2+ - 2,4 мкМ, аскорбата - 200 мкМ), фотохимическое окисление, УФ-облучение - и величина его достигала 20 %. При плотности мощности меньше 0,2 мВт/см2 ускорения ПОЛ выявить не удалось. Объяснение эффекта ускорения ПОЛ общим нагревом препаратов, по-видимому, исключено. Так как скорость ПОЛ в мембранных системах сильно зависит от их структурного состояния [31], можно предположить, что обнаруженный этими авторами эффект связан с какими-то структурными изменениями мембран липосом или окружающей их воды при поглощении КВЧ-излучения.

В другой своей работе [33] авторы склонны объяснять эффекты ММ облучения при интенсивности 2 - 3 мВт/см2 ускорением процессов переноса протонов в воде на акцептор, что, повидимому, связано с высоким поглощением ММ излучения молекулами воды.

Существует в то же время ряд работ, рассматривающих иные свойства КВЧ-излучения при действии его на спектр объектов от модельных систем до интактных организмов.

При применении КВЧ-излучения в комплексном лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы показано, что миллиметровое излучение обладает выраженным антиоксидантным действием, причем изменение содержания продуктов перекисного окисления липидов и увеличение антиоксидантного потенциала крови коррелирует с клиническим эффектом проводимых процедур [34]. При исследовании показателей перекисного окисления липидов крови у больных нестабильной стенокардией было показано влияние ММ-терапии на нормализацию показателей и антиоксидантную систему организма [35].

Отмечалось, что усиление свободнорадикальных реакций в мембранах клеточных элементов крови ведет к изменению проницаемости мембраны эритроцитов. Рецепция ММ волн разными видами тканей, по-видимому, связана со свободнорадикальными реакциями типа перекисного окисления липидов [36]. Мы уже говорили о работах, где изучалось усиление перекисного окисления липидов в липосомах и бислойных мембранах, на коже лягушки, что связывалось с конвекцией на границах фаз [32].

Изменение активности перекисного окисления липидов и тиол-дисульфидного обмена по реакции конечных продуктов окисления с 2-тиобарбитуровой кислотой при облучении ММ волнами интактных животных наблюдалось в работе [37].

В интересных работах, вышедших в последнее время, рассматривается регуляция активности супероксиддисмутазы и образование реактивных форм кислорода в водных растворах под действием КВЧ-излучения [22, 38].

Авторы [22] показали, что при облучении Na2CO3/NaHCO3 буфера СВЧ-полем 0,8 см диапазона (в сущности КВЧ-диапазона при lambda = 8 мм) в буфере образуются микромолярные концентрации перекиси водорода и, возможно, другие долгоживущие продукты, и предположили, что K - Ca - каналы активируются облученным буфером благодаря образующейся там перекиси водорода. В работе [38] было показано значительное образование реактивных форм кислорода, в частности, перекиси водорода в водных растворах под действием КВЧ-излучения, которые могут сохраняться в течение длительного времени и осуществлять опосредованное действие КВЧ-излучения на биосистемы.

Большинство имеющихся работ таким образом указывает на мембраны клеток различных объектов от растительных до мембран эритроцитов как на основное место приложения ММ излучения, где разворачиваются первичные механизмы, определяющие конечные эффекты действия. Различна, по мнению разных авторов, лишь суть механизмов, происходящих в мембранах. Приведенные литературные и наши данные по снятию действия КВЧ-излучения отсуствием О2, на наш взгляд, указывают на накопление в липидной фазе, в первую очередь мембран, перекисных и свободнорадикальных состояний, делая эту стадию воздействия КВЧ-излучения определяюще важной по сравнению с конвективным переносом веществ.

В наших экспериментах обнаружено исчезновение стимулирующего эффекта КВЧ-излучения на прирост биомассы S.platensis после добавления селенита натрия (Na2SeO3) в концентрации 50 мг/л на 10 сутки культивирования (рисунок). Известно, что соединения селена проявляют значительную антиоксидантную активность и значит должны уменьшать концентрацию перекисных и свободнорадикальных состояний, что подтверждает высказанное нами положение. Согласно работе, селен включается в активные центры глутатионпероксидазы и пероксидазы [39]. Показано также, что присутствие селенита натрия индуцировало образование глутатионпероксидазы у Chlamydomonas [40].

Рассматривая действие миллиметровых волн нужно учитывать ряд их особенностей. Известно, что при использовании низкоинтенсивных электромагнитных колебаний миллиметрового и субмиллиметрового диапазона длин волн с плотностью мощности порядка нескольких единиц, не более 10 мВт/см2 общий нагрев облучаемого вещества (тепловой массаж) является, видимо, несущественным и составляет величину порядка 0,1 С [41], хотя есть исследователи, придающие ему определенное значение.

К тому же энергия кванта излучения , даже в этой коротковолновой части КВЧ диапазона, остается все еще меньше энергии теплового движения, что делает нагревание объектов проблематичным. Верхним энергетическим порогом нетепловых биологических эффектов ММ волн можно считать величину Р = 10 мВт/см2 [42].

Таким образом, взаимодействие КВЧ-излучения с биологическими объектами, видимо, не обусловлено нагревом вещества.

Далее важно, что излучение в ММ диапазоне сильно поглощается различными веществами, в том числе водой и водными средами. Например, плоский слой воды толщиной 1 мм ослабляет излучение при lambda = 8 мм на 20 дБ [27], при длине волны 7,1 мм в 100 раз, а при длине волны 2 мм - в 10 000 раз.

Весьма важным нам всегда казалось несоответствие между малой величиной поглощенной энергии при однократном КВЧ-облучении фотосинтезирующих организмов и величиной "ответа", выражающейся в ускорении роста и значительном увеличении выхода биомассы. Это позволяет нам говорить об изменениях транспортной функции мембран, связанных, возможно, с наличием самоускоряющихся механизмов, развивающихся в их липидной фазе, как о важнейшей вероятной причине, влияющей на метаболизм облученных клеток, в том числе на проявление стимулирующих эффектов.

Если попытаться подсчитать поглощенную биологическим объектом энергию КВЧ-излучения, например, цианобактерией Spirulina platensis при однократном облучении ее в наших опытах, то следует, видимо, учитывать площадь облучаемой поверхности, мощность облучения и время воздействия. Например, облучение мы производили в круглых фторопластовых сосудах типа чашек Петри диаметром 5,5 см при мощности излучения порядка 2,2 мВт/см2 и lambda = 8,34 мм. Тогда за время облучения, равное 30 мин (оптимальное время для стимуляции роста S.platensis), чашка получит при однократном облучении, как показывает простой расчет, количество поглощенной энергии приблизительно равное 94 Дж или примерно 24 кал. Так как облучаемый объект находится в водной суспензии с толщиной слоя около 0,5 мм, то КВЧ-излучение ослабляется в этом слое, но и сами цианобактерии занимают при концентрации 0,03 г/л лишь небольшую часть облучаемого инокулята и все это, как нам кажется, дает основания уменьшить величину поглощенной энергии, как минимум, еще на порядок. При таких величинах нагревание объекта вряд ли может серьезно рассматриваться.

Тем не менее, как мы говорили, такое малое количество однократно поглощенной энергии вызывает как у прокариотных, так и у эукариотных фотосинтетических организмов такие весьма существенные последствия, как ускорение роста, увеличение выхода биомассы в 2-2,5 раза, увеличение количества пигментов в клетке до 3,5 раз, и уровня экскреции органических соединений в среду, что на наш взгляд свидетельствует о присутствии самоускоряющихся механизмов в развитии последствий облучения.

При изучении поглощения (выделения) ионов калия, натрия, хлора и нитрата в период роста цианобактерии S.platensis после воздействия КВЧ-излучения нами было показано, что концентрация ионов, особенно натрия и нитрата, в культуральной жидкости изменялась в зависимости от возраста культуры и параметров облучения [43 - 45].

Обнаружен двухфазный характер транспорта иона натрия у облученной культуры S.platensis. После облучения мы наблюдали изменения и в быстрой, и в медленной фазах кинетических кривых, отражающих транспорт натрия, что проявлялось уже на 10 сутки культивирования и зависело от параметров облучения. Определяющим для обоих типов транспорта является степень проницаемости поверхностной мембраны клетки [46]. Наши данные подтверждают мнение о том, что первичное действие КВЧ-излучения состоит в изменении проницаемости мембран и их транспортных свойств. Присутствие кислорода, очевидно, важно для возникновения изменений функционального состояния мембран, их проницаемости и для развития реакций последействия во времени, идущих по принципу самоускорения, как главных причин выраженного стимулирующего действия КВЧ-излучения на фотосинтезирующие объекты.

Подобные механизмы описывались ранее, например, при развитии первичных реакций лучевого поражения под влиянием гамма-излучения и представляли собой реакции цепного автокаталитического типа [21]. В пользу этого говорил ряд фактов, в частности, наличие несоизмеримости количества поглощенной энергии при действии гамма-излучения и ответной реакции организма позволило еще в 50 - х годах сформулировать гипотезу о решающей роли цепного окисления липидов в действии ионизирующей радиации, а затем - и в действии других повреждающих факторов [21]. Большой школой химиков было показано, что процесс образования перекисей липидов в подобных явлениях имеет цепной, свободнорадикальный механизм, характерный вообще для реакций окисления органических соединений непосредственно молекулярным кислородом [47].

Это не означает знака равенства в механизмах действия КВЧ-излучения и ионизирующей радиации, но некоторые внешние проявления имеют здесь сходство. Подобным действием обладает, по-видимому, и ультрафиолетовое облучение, вызывающее образование свободных радикалов в биологических системах и накопление перекисей. Ряд авторов отмечает, что УФ-облучение приводит к изменению транспорта ионов через мембрану: перекисное окисление липидов в мембранах приводило к повышению их проницаемости при сравнительно небольших дозах УФ [48]. Известно, что перекисное окисление связано также с потреблением кислорода, возможно поэтому при изучении действия УФ-облучения на биомолекулярные фосфолипидные мембраны [49] оказалось, что облучение в атмосфере аргона было значительно менее эффективным, чем в присутствии растворенного кислорода.

Весьма вероятно, что присутствие кислорода при КВЧ-облучении ответственно за дальнейшее образование и накопление радикальных и перекисных состояний и развитие автокаталитических реакций типа цепных, идущих в липидной фазе клеток, в первую очередь, мембран с накоплением конечных продуктов, приводящих к изменениям их функционального состояния, подобно тому, как это было показано ранее при облучении ионизирующей радиацией [21].

Таким образом, одной из причин нетеплового влияния КВЧ-излучения на биологические объекты может быть воздействие образуемой перекиси водорода, сильного акцептора электронов, способного регулировать функционирование многих ферментативных систем. Присутствие образующихся перекисей могло бы интенсифицировать процессы фотосинтеза вместе с накоплением пигментов, что мы и наблюдали в результате КВЧ-облучения [11]. Это хорошо совпадает со взглядами, согласно которым, фотосинтетический кислород формируется не из воды, а из пероксида водорода экзогенного и эндогенного происхождения [49, 50], и значит увеличение перекисей под действием каких-либо факторов в клетке соответствовало бы интенсификации фотосинтеза.

Вопросы пролонгированности действия КВЧ-излучения обсуждались в литературе, но не получили на наш взгляд окончательного толкования. Их пробовали связывать как с "памятью воды", так и с некими неизвестными свойствами клетки.

В работах [51] отмечается, что время "памяти" воздействия КВЧ-излучения на микроорганизмы даже при их постоянных пересевах может достигать нескольких месяцев, причем возвращение к исходным свойствам совершается постоянно. Наблюдается, по мнению авторов, "запоминание" организмом воздействий КВЧ на более или менее длительное время [52, 38].

По нашим данным действие КВЧ-излучения на фотосинтезирующие организмы имеет пролонгированный характер, постепенно ослабевая ко второму пассажу на фоне сохраняющегося повышенного количества пигментов в клетках (табл.1). Эти данные свидетельствуют о сохранении стимулирующего эффекта облучения на прирост биомассы при последующих пассажах облученной культуры S.platensis. В связи с этим представляло интерес выяснить, как меняется при этом фотосинтетическая активность. Оказалось, что она у облученных ранее культур гораздо выше контрольных, что совпадает с данными по приросту биомассы. К 30 суткам роста фотосинтетическая активность во всех вариантах выравнивалась (табл.2).

Табл.1. Пролонгированное действие стимулирующего эффекта КВЧ-излучения у S.platensis (биомасса в г/л)